Un des éléments régulateurs du cycle cellulaire est donc la variation cyclique et coordonnée de l’activité des différents complexes cycline: Cdk. Ces fluctuations sont dues à une régulation des Cdk par phosphorylation et à un contrôle des niveaux de cyclines dans le noyau cellulaire. Les signaux mitogènes (par exemple sous le contrôle des gènes Myc et Ras) induisent la synthèse de cycline D. Les gènes codant pour les cyclines E et A sont quant à eux sous le contrôle positif des complexes transcriptionnels E2F (Figure 3, C4). Inversement, c’est par leur dégradation que les niveaux de cyclines sont contrôlés négativement à des points précis du cycle cellulaire. Par exemple, la transition G2→M nécessite la dégradation de la cycline B par le complexe MPF (mitosis promoting factor). Par ailleurs, dans des conditions normales, la dégradation de la cycline E par ubiquitinylation et protéolyse dans le protéasome joue un rôle important dans la progression de la prolifération cellulaire [ 7]. Amplification génétique ou déficience des voies de dégradation pourraient être toutes deux à l’origine d’une élévation des niveaux de cyclines D et E en particulier, et donc d’une activation des complexes cyclines:Cdk dans certains cancers. Une des molécules récemment impliquées est l’ubiquitine ligase hCdc4 qui pourrait agir comme gène suppresseur de tumeurs [7] par dégradation des cyclines.

La distribution cellulaire des cyclines est également un élément régulateur de l’activité des complexes cycline:Cdk. Par exemple, pendant l’interphase, la cycline B1 est principalement dans le cytoplasme. En revanche, au moment de la transition G2→M, la phosphorylation de la cycline B1 bloque sa sortie du noyau, ce qui concentre les complexes cycline B1:Cdk1 au niveau nucléaire et leur permet d’activer leurs substrats.

L’activité kinase des Cdk est modulée par phosphorylation. Les Cdk sont activées par la phosphorylation d’une thréonine dans la portion carboxy-terminale des Cdk par les kinases CAK (pour cyclin activated kinase, ou complexe CycH:Cdk7) (Figure 4, D-E2) et c-TAK1. Le résidu cible est la thréonine 161 pour Cdk1, 160 pour Cdk2 et 172 pour Cdk4. Inversement, les Cdk sont inactivées par phosphorylation du site ATP dans leur portion aminoterminale (tyrosine 15 et thréonine 14) par les kinases Wee1 et Myt1 (Figure 3, C3; Figure 4, C-D2). L’activation de la prolifération cellulaire par la kinase Akt (ou protéine kinase B, PKB) a très récemment été attribuée à une phosphorylation qui inactive Myt1, ce qui empêche l’inactivation de la Cdk1.

L’activation des Cdk peut également être obtenue par déphosphorylation de leur résidu tyrosine 15 ou thréonine 14 par les phosphatases de la famille Cdc25. Les trois phosphatases de la famille Cdc25 (Cdc25A, Cdc25B et Cdc25C) sont très similaires (l’homologie est de l’ordre de 50 % au niveau des séquences de protéines) [ 8], bien qu’elles fonctionnent à différents points du cycle cellulaire. La protéine Cdc25A est nécessaire pour l’entrée en phase S (Figure 3, A4), alors que Cdc25B et Cdc25C assurent le passage en mitose (Figure 3, A4; Figure 4, C1-2). Cdc25C peut être activée par phosphorylation par la Polo kinase Plk1 et le complexe cycline B1:Cdk1 (Figure 4, C1). Ainsi, il a été proposé que Cdk1 serait soumise à une boucle de rétro-activation ayant pour finalité de produire un passage sans retour de la phase G2 à la mitose. Au stade de la mitose, Cdk1 devient inactive.

Les membres de la famille Cip/Kip (p21^{Waf1/Cip1/Sid1}, p27^Kip1 et p57^kip2) se lient aux complexes cycline:Cdk en formant des hétérotrimères (Figure 2). La p27^KIp1 est un gène suppresseur de tumeur bien établi, qui empêche la progression cellulaire en phase S en bloquant les complexes cycline E:Cdk2 et cycline A:Cdk2. La p21^{Waf1/Cip1/Sid1} a une spécificité plus large, puisqu’elle inhibe l’activité des complexes cycline E/A:Cdk2 et cycline B:Cdk1. Le gène p21^{Waf1/Cip1/Sid1} n’est généralement pas muté dans les tumeurs. La p21^{Waf1/Cip1/Sid1} est l’un des principaux médiateurs de l’arrêt du cycle cellulaire en réponse à divers stress cellulaires: en particulier, son promoteur est activé par la p53 (Figure 3, B1; Figure 4, D5). Dans certaines conditions, les protéines Cip/Kip pourraient également activer la progression du cycle cellulaire en facilitant la terminaison de la phase G1 et le début de la phase S. Cet effet s’expliquerait par la fixation des Cip/Kip aux complexes cycline D:Cdk4-6 qu’elles activeraient, et par libération et activation des complexes cycline E/A:Cdk2.

Les protéines de la famille pRb (pRb, pour retinoblastoma protein, p130 et p107), en se fixant aux protéines E2F, bloquent d’une façon générale leur activité transcriptionnelle (Figure 3, C4) dans les cellules quiescentes ou en début de phase G1. Cette inhibition de la transcription s’exerce également sous l’action du recrutement, par les protéines pRb, de désacétylases des histones (HDAC pour histone deacetylases), qui ont pour effet de compacter la chromatine et de la rendre inaccessible aux facteurs de transcription, en particulier E2F et DP. Dans les cellules quiescentes, les complexes E2F:DP1 sont inactivés par leur liaison à p130, celle-ci se trouvant substituée par pRb durant la phase G1. Pour assurer la transition G1→S, les complexes cycline D:Cdk4-6 phosphorylent pRb, ce qui entraîne un blocage de l’interaction pRb-E2F et permet à E2F d’activer l’expression des gènes codant pour les protéines essentielles à l’entrée en phase S et à la réplication de l’ADN. À l’inverse, les CKI maintiennent pRb dans son état répresseur, hypophosphorylé, en bloquant l’activité des kinases Cdk4 ou Cdk6 (Figure 3, B2-3). La terminaison de la phase S nécessite l’intervention de Cdk2 qui dissocie E2F de ses sites de liaison sur l’ADN.

La famille E2F est composée de 6 membres, activés par hétérodimérisation avec les protéines DP (DP1 ou DP2). Certains d’entre eux, les facteurs E2F4, E2F5 et surtout E2F6, pourraient avoir un effet régulateur négatif sur la transcription des gènes dépendant des facteurs E2F1-3:DP, par un effet compétitif de liaison avec les facteurs DP sur les mêmes promoteurs. Les gènes sous le contrôle des facteurs E2F:DP sont multiples [ 10]. Dans le groupe des gènes impliqués dans le cycle cellulaire, figurent les cyclines A et E, Cdk2 et Cdk1, Cdc25A, mais aussi pRb et p107. Les facteurs E2F activent également la transcription de gènes codant pour des protéines de réplication (Orc1, Mcm, Cdc6, Rfc 2-4, PCNA pour proliferating cell nuclear antigen), des enzymes nécessaires à la synthèse de l’ADN (ADN polymérase α, thymidylate kinase, dihydrofolate réductase), les systèmes de réparation de l’ADN (UDG, MutS, MutL, Rad51, DNA-PK, BRCA1), différents effecteurs des points de surveillance (p53, Chk1) et l’oncogène Myc (Figure 3, C4).

(→) m/s 2001, n°11, p. 1226

Une autre voie impliquée dans la prolifération cellulaire est celle de l’oncogène Myc, dont l’expression est ellemême étroitement liée à la prolifération cellulaire [11]. Myc est une protéine labile qui se fixe à son partenaire Max, une protéine stable et dépourvue d’activité transcriptionnelle propre. L’hétérodimère Myc:Max active la transcription en se fixant spécifiquement sur des séquences consensus de type boîtes E (E-boxes) (CANNTG). Parmi les gènes activés par Myc se trouvent ceux des cyclines D et E et de la phosphatase Cdc25A (Figure 3, A5) [ 12], qui toutes trois ont des rôles clé dans la transition G0→G1. Myc activerait également la transcription des gènes codant pour la protéine Cdk4 et les facteurs E2F (E2F2, E2F3 et Id2), et réprimerait celle du gène suppresseur de tumeur p21 [12].

Le TGFβ entraîne généralement l’arrêt de la prolifération celluaire, et la voie TGFβ est communément altérée dans les cancers. Le TGFβ produit cet effet à plusieurs niveaux: en réprimant l’expression de Myc, et en induisant l’expression de p15^INK4b et de p21^Waf1/Cip1 (dans certaines cellules).

L’induction de l’expression de la cycline E par E2F et Myc et, par voie de conséquence, l’activation de la kinase Cdk2 entraînent la phosphorylation de pRb (Figure 3, B4) et p27^Kip1 (Figure 3, C1). La phosphorylation, et donc l’inactivation de pRb, crée une boucle rétro-activatrice qui libère l’activité d’E2F et contribue à l’irréversibilité de la transition G1→S, ce qui définit le point de restriction.

Pendant les phases S et G2, les kinases dépendantes des cyclines A et B (Cdk1 et Cdk2 sous forme de complexes avec leurs cyclines correspondantes) maintiennent la phosphorylation et l’inactivation de pRb, jusqu’au moment où les cellules sortent de mitose. La phosphorylation de l’inhibiteur de Cdk p27^Kip1 par le complexe cycline E:Cdk2 conduit à sa dégradation (Figure 3, C1). Par ailleurs, ce même complexe active la synthèse d’ADN en phosphorylant Cdc45 (Figure 3, C1), et augmente la synthèse des histones en phosphorylant le facteur de transcription p220/NPAT (Figure 3, D1). L’activation du complexe cycline E:Cdk2 induit également la duplication des centrosomes en phosphorylant la nucléophosmine et la kinase MpS1.

La kinase ATM est inactivée par mutation de son gène chez les malades atteints d’ataxie-télangiectasie, maladie autosomique récessive dont la caractéristique cellulaire est une déficience des points de surveillance du cycle cellulaire [ 15]. Ainsi, malgré la présence de coupures dans l’ADN, les cellules de patients atteints d’ataxie-télangiectasie continuent de proliférer et de synthétiser leur ADN, sans s’arrêter ni en phase S, ni en phase G2, c’est-à-dire sans laisser au système de réparation de l’ADN le temps d’agir. Il en résulte une hypersensibilité aux radiations ionisantes et aux agents inducteurs de lésions de l’ADN.

La kinase ATR étant essentielle à la survie cellulaire, aucune tumeur connue impliquant ATR n’a pu être détectée. Néanmoins, des travaux récents démontrent l’importance de la kinase ATR dans le signalement des anomalies au niveau des fourches de réplication, qui peuvent être observées au cours des lésions induites par les rayons ultraviolets ou les camptothécines, inhibiteurs des topo-isomérases I utilisés en chimiothérapie anticancéreuse, produisant des coupures double-brin de l’ADN au niveau des fourches de réplication [ 16].

La kinase DNA-PK est non seulement impliquée dans les points de surveillance du cycle cellulaire, mais aussi dans les recombinaisons non homologues de l’ADN. Elle est activée par les coupures double-brin de l’ADN [14]. Les anomalies de DNA-PK produisent des syndromes d’immunodéficience par défaut de recombinaison V(D)J des gènes des immunoglobulines G et du récepteur des lymphocytes T, et anomalies de maturation des cellules T.

Le rôle central des kinases ATM et ATR, et peut-être de la DNA-PK, dans les points de surveillance du cycle cellulaire est attesté par l’activité régulatrice de ces protéine kinases sur des protéines clé effectrices de la surveillance cellulaire telles que p53, Mdm2, le complexe cohésine, les kinases Chk1 et Chk2 (Figure 3, A1-2-3; Figure 4, A3-4) et différents détecteurs (sensors) tels que NBS1, BRCA1, hRad9 et hRad17.

Il semble donc exister deux voies parallèles dans les cellules de mammifères: la voie ATR-Chk1 et la voie ATMChk2. La voie ATR-Chk1 répond principalement aux blocages des fourches de réplication et aux lésions produites par les rayons ultraviolets (Figure 4, A3), alors que la voie ATM-Chk2 répond aux cassures double-brin de l’ADN (Figure 4, A4). Nous avons récemment montré que l’inactivation de Chk2 par l’expression d’un oligonucléotide antisens diminue le ralentissement des phases S et G2 induit par le traitement des cellules par la camptothécine [ 17]. Cela souligne l’importance de Chk2 dans les mécanismes d’arrêt du cycle cellulaire mis en jeu lors des chimiothérapies.

Chk1 et Chk2 ont des substrats communs (p53 [Figure 4, B4], Cdc25 [Figure 4, C1] et BRCA1), et pourraient donc posséder des fonctions partiellement redondantes destinées à assurer la solidité du point de surveillance du cycle cellulaire. Chk2 semble jouer un rôle majeur en permettant la persistance de l’arrêt en G2, alors que Chk1 semble plus spécifiquement impliquée dans l’induction de l’arrêt en G2 [ 18].

Le second mécanisme est plus lent, car il implique l’activation de la protéine p53 et nécessite que soient exprimés les gènes activés par p53 (Figure 3, B1). Dans des conditions normales, p53 a une demi-vie très courte, et n’est présente qu’en faible quantité. Diverses perturbations (lésions de l’ADN, hypoxie ou surexpression d’oncogènes) augmentent les niveaux cellulaires de p53 (Figure 4, C4-5), principalement par sa phosphorylation sur la sérine 15 (par les kinases ATM et ATR, Figure 4, BC4) et sur la sérine 20 (par la kinase Chk2, mais aussi par les kinases Chk1 et Plk3) (Figure 4, B-C4-5). En effet, la phosphorylation de p53 réduit sa fixation de Mdm2, ce qui diminue son ubiquitinylation (sous le contrôle de Mdm2) et empêche ainsi sa dégradation dans le protéasome [ 19] (Figure 4, C4). La stabilisation de p53 induit l’expression de p21^Waf1/Cip1 (Figure 4, C3) (inhibiteur des complexes cycline E/A:Cdk2 et cycline B:Cdk1), qui s’accompagne de l’arrêt du cycle cellulaire, et celle de gènes impliqués dans l’apoptose (Bax, DR5, Noxa, Fas). La protéine p53 induit également l’expression de Mdm2, ce qui produit un effet de rétrocontrôle négatif (feed-back loop) (Figure 4, D4-5). Lorsque la protéine p53 est déficiente, l’arrêt en G1 est atténué et les cellules entrent en phase S malgré la présence d’anomalies de l’ADN [ 20]. La protéine p14^ARF est le produit d’un gène suppresseur de tumeurs (ARF) qui inactive Mdm2 en induisant sa translocation vers le nucléole, inhibe son activité ubiquitine ligase et augmente l’acétylation (donc la stabilisation) de p53 en bloquant l’effet inhibiteur de Mdm2 sur l’acétylase p300/CBP. La protéine ARF serait également induite par les radiations ionisantes, ce qui aurait pour effet de contribuer indirectement à l’activation de p53. L’importance de ARF comme régulateur positif de la voie p53 est attestée par le fait que les souris knock-out pour le gène ARF ont la même prédisposition aux tumeurs que les souris knock-out pour le gène de p53.

Les kinases Chk1 et Chk2 jouent un rôle prédominant dans la réponse rapide, en phosphorylant Cdc25C sur la sérine 216 (Figure 4, C1). Cette phosphorylation crée un site d’attachement pour la protéine 14-3-3σ (Figure 4, C-D1), ce qui entraîne la séquestration de Cdc25C dans le cytoplasme, à distance de son substrat nucléaire, Cdk1. Des déficiences génétiques de 14.3.3 ont été impliquées dans les anomalies du point de surveillance G2 dans les cancers pulmonaires à petites cellules. Récemment, une nouvelle kinase de la famille des Polo kinases, Plk3, a été identifiée comme ayant les mêmes effets que Chk1 et Chk2 [ 21] (Figure 4, B-C1). Les lésions de l’ADN peuvent également inactiver Cdc25C en inhibant l’action de la Polo kinase Plk1, nécessaire à son activation (Figure 4, C1). L’inactivation de Cdk1 par les lésions de l’ADN peut aussi s’exercer via une hyperphosphorylation de son résidu Tyr15, par activation de Wee1 [ 22]. La réponse rapide peut aussi être due à une séquestration des complexes cycline B:Cdk1 dans le cytoplasme de cellules portant des lésions de l’ADN. Cela a pour effet d’empêcher la phosphorylation des substrats nucléaires impliqués dans la transition G2→M. La protéine p53 n’est pas nécessaire pour la décision d’arrêt en G2, mais elle joue un rôle dans sa persistance en bloquant l’activité du complexe kinase cycline B:Cdk1 [5]. Le contrôle qu’elle exerce emprunte diverses voies moléculaires (Figure 4, C3): l’induction de p21^Waf1/Cip1 inhibe directement la kinase Cdk1, mais bloque également CAK, qui normalement active Cdk1 par phosphorylation de sa thréonine 161 ; l’induction de Gadd45 bloque elle aussi l’activité de la kinase Cdk1; l’induction de 14-3-3σ provoque la séquestration de la cycline B1 et de sa kinase Cdk1, ainsi que de Cdc25C dans le cytoplasme; la protéine p53 peut aussi réprimer l’expression des gènes Cdk1 et de la cycline B1 dont les promoteurs contiennent un site p53 (Figure 4, C5). Le nombre des voies moléculaires qui contrôlent le complexe cycline B1:Cdk1 est donc remarquable, reflétant l’importance d’une telle régulation.

Certains virus oncogènes peuvent activer directement les complexes cyclines:kinases de la phase G1, indépendamment de la protéine p53. Ainsi, le virus du sarcome de Kaposi (KSHV/HHV8) code pour une protéine homologue de la cycline D2 qui forme un complexe actif avec la protéine kinase Cdk6 (Figure 3, B1-2). Ce complexe induit également la dégradation de p27^Kip1, ce qui contribue à l’activation des complexes cycline D:Cdk4/6.

L’oncogène Myc est fréquemment amplifié dans les cancers [12, 24]. Outre des mécanismes moléculaires d’activation transcriptionnelle impliqués dans la transition G0→G1 et le point de restriction, Myc s’oppose à l’activité antiproliférative de TGFβ. Cet antagonisme peut s’expliquer par une liaison de Myc aux complexes transcriptionnels Smad/Sp1, impliqués dans la voie de signalisation du TGFβ, ainsi que par une répression directe des promoteurs des gènes p15^INK4b et p21^Waf1/Cip1 .

Les mutations de la protéine kinase ATM sont responsables des syndromes d’ataxie-télangiectasie, qui prédisposent aux lymphomes et aux leucémies lymphoïdes chroniques (B ou T) [15]. Lorsque le gène ATM est normal (AT-like disorders), les mutations se situent au niveau de Mre11, un des éléments du complexe MRN (Mre11/Rad50/NBS1) impliqué dans la réparation des coupures double-brin de l’ADN. Les mutations de NBS1 sont quant à elle associées au syndrome de Nimègue (NBS pour Nijmegen breakage syndrome). Le groupement de ces anomalies moléculaires sous un syndrome commun paraît logique si l’on considère que la protéine ATM contrôle l’activité du complexe MRN en phosphorylant NBS1 (pour revue voir [ 27]).

Les mutations de BRCA1, qui est aussi un des gènes suppresseurs de tumeurs agissant sur les points de surveillance du cycle cellulaire, prédisposent aux cancers de l’ovaire et du sein (pour revue voir [27]).